Un instrument d'analyse appelé spectrophotomètre UV-visible mesure la quantité de lumière ultraviolette (UV) et visible absorbée par un échantillon. En chimie, en biochimie et dans d'autres sciences, il s'agit d'une méthode largement utilisée pour localiser et mesurer des composés dans divers matériaux.
La mesure et l'interprétation du rayonnement électromagnétique émis ou absorbé lorsque les molécules, les atomes ou les ions d'un échantillon changent de niveau d'énergie sont appelées spectroscopie. En spectroscopie ultraviolette (UV), les molécules absorbent la lumière dans la gamme ultraviolette (200-400 nm), ce qui excite les électrons de leur état fondamental à un état excité. Ce type de spectroscopie est similaire à la spectroscopie d'absorption.
Les données de spectroscopie UV-visible peuvent fournir des informations qualitatives et quantitatives sur une substance ou une molécule spécifique. Que des informations quantitatives ou qualitatives soient souhaitées, une cellule de référence doit être utilisée pour mettre à zéro l'instrument pour le solvant dans lequel le composé est présent. Pour obtenir des informations quantitatives sur le composé, étalonnez l'instrument avec des quantités connues du composé en question dans une solution contenant le même solvant que l'échantillon inconnu. Si l'information recherchée consiste simplement à vérifier la présence d'un composé dans l'échantillon testé, une courbe d'étalonnage n'est pas nécessaire ; en revanche, si une étude ou une réaction de dégradation est réalisée et que la concentration du composant en solution est requise, une courbe d'étalonnage est requise.
Pour créer une courbe d'étalonnage, au moins trois concentrations de la substance sont nécessaires, mais cinq concentrations sont préférables pour une courbe plus précise. Les concentrations doivent commencer juste au-dessus de la concentration prévue de l'échantillon inconnu et diminuer progressivement jusqu'à environ un ordre de grandeur en dessous de la concentration maximale. Les solutions d'étalonnage doivent être espacées de manière raisonnablement régulière et préparées avec la plus grande précision possible à l'aide de pipettes numériques et de fioles jaugées plutôt que d'éprouvettes et de béchers gradués. Exemple de spectre d'absorbance pour les solutions d'étalonnage de rose Bengale (4,5,6,7-tétrachloro-2',4',5',7'-tétraiodofluorescéine).
Pour créer une courbe d'étalonnage, utilisez les valeurs d'absorbance de chacune des courbes spectrales à la longueur d'onde d'absorption la plus élevée. Un étalonnage acceptable présente un coefficient de corrélation d'au moins 0,9. Si le coefficient de corrélation est inférieur à ce seuil, réessayez les solutions, car le problème pourrait être dû à une erreur humaine. Cependant, si l'étalonnage reste insatisfaisant après plusieurs solutions, il se peut que l'instrument présente un problème ; par exemple, l'éclairage est peut-être défaillant.