La chromatographie liquide haute performance, également appelée chromatographie liquide haute pression, est une technique chromatographique de séparation d'un mélange de substances. Elle est utilisée en biochimie et en chimie analytique pour identifier, mesurer et purifier les constituants du mélange. Un échantillon liquide est injecté dans un flux de solvant (phase mobile) qui traverse une colonne contenant un milieu de séparation (phase stationnaire). À mesure que les échantillons traversent la colonne, ils se séparent les uns des autres par un processus appelé migration différentielle. Le système CLHP se compose principalement d'une pompe à perfusion, d'un échantillonneur, d'une colonne chromatographique, d'un détecteur et d'un dispositif d'enregistrement et de traitement des données. Les principaux composants sont la pompe à perfusion, la colonne chromatographique et le détecteur.
Martin et Synge ont décrit la découverte de la chromatographie de partage liquide-liquide en 1941, jetant ainsi les bases de la chromatographie gaz-liquide et de la chromatographie liquide haute performance. Ils ont également proposé la notion de hauteur équivalente aux plateaux théoriques, qui a depuis été acceptée comme mesure de l'efficacité chromatographique.
TYPES DE TECHNIQUES HPLC :
1. Chromatographie en phase normale
2. Chromatographie en phase inverse
3. Chromatographie d'échange d'ions/chromatographie ionique
4. Chromatographie d'exclusion stérique
5. Chromatographie de bioaffinité
6. Chromatographie de partage
TYPES DE TECHNIQUES D'ÉLUTION :
1. Séparation isocratique
2. Séparation par gradient
Une séparation HPLC est considérée comme une élution isocratique si la composition de la phase mobile ne change pas au cours du processus. Modifier le rapport entre les composés polaires et non polaires dans la phase mobile pendant l'analyse de l'échantillon est souvent le seul moyen d'éluer chaque composé chimique de l'échantillon dans un délai raisonnable tout en conservant la résolution des pics. Cette méthode, appelée chromatographie par gradient, est privilégiée lorsqu'un échantillon présente des constituants présentant une large plage de polarité. Dans le cas d'un gradient en phase inverse, le solvant devient progressivement moins polaire après avoir commencé à être relativement polaire. La séparation des pics la plus complète est obtenue par l'élution par gradient, qui est rapide. L'élution par gradient permet de séparer un échantillon composé de produits chimiques présentant une large gamme de polarités en un temps plus court, sans compromettre la résolution des pics précoces ni élargir excessivement les pics ultérieurs. En revanche, l'élution par gradient nécessite un équipement plus complexe et coûteux, ainsi qu'une plus grande difficulté à maintenir un débit constant, la composition de la phase mobile changeant constamment. L'élution par gradient, en particulier à grande vitesse, met en évidence les limites des appareils expérimentaux de moindre qualité, rendant les résultats moins reproductibles dans un équipement déjà sujet à des variations. Si le débit ou la composition de la phase mobile change, les résultats ne seront pas reproductibles.
Le détecteur HPLC, placé en bout de colonne, doit enregistrer la présence de divers composants de l'échantillon tout en excluant le solvant. Par conséquent, il n'existe pas de détecteur universel efficace pour toutes les séparations. Un détecteur d'absorption UV est un détecteur HPLC populaire, car la plupart des molécules de moyenne à grande taille absorbent le rayonnement UV. Les détecteurs de fluorescence et d'indice de réfraction sont également utilisés dans des applications spécialisées. L'association d'une séparation HPLC et d'un détecteur RMN est une invention relativement récente. Elle permet d'identifier et de mesurer les composants purs de l'échantillon par résonance magnétique nucléaire après séparation par HPLC, au sein d'un processus intégré unique.
Si la phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile, la séparation est considérée comme une phase normale. Si la phase stationnaire est moins polaire que la phase mobile, la séparation se produit en phase inverse. En HPLC en phase inverse, la période de rétention d'un composé augmente à mesure que la polarité de l'espèce diminue. La clé d'une séparation efficace et efficiente réside dans la recherche du juste équilibre entre les composants polaires et non polaires dans la phase mobile. L'objectif est d'obtenir une élution aussi rapide que possible de tous les produits chimiques, tout en permettant la résolution des pics individuels. Les colonnes classiques pour la séparation en phase normale sont remplies d'alumine ou de silice. La séparation en phase inverse est généralement réalisée à l'aide de phases alkyle, aliphatique ou phényle. La HPLC est utile pour les applications quantitatives et qualitatives, ou pour l'identification et la quantification de composés. De nos jours, la HPLC en phase inverse peut être utilisée pour la quasi-totalité des séparations HPLC, la HPLC en phase normale étant extrêmement rare. La chromatographie par échange d'ions est une méthode plus efficace pour séparer les ions inorganiques que la HPLC en phase inverse (RPLC), qui est inefficace pour la plupart des types de séparations. Elle est incapable de séparer les polynucléotides (qui s'adsorbent de manière irréversible sur le substrat en phase inverse) ni les polysaccharides (qui sont trop hydrophiles pour permettre une adsorption en phase solide). Enfin, la RPLC présente une sélectivité limitée et ne permet pas de séparer efficacement les molécules extrêmement hydrophobes. À quelques exceptions notables près, la quasi-totalité des autres types de composés peuvent être séparés par RPLC. La RPLC permet de séparer avec succès des hydrocarbures simples et aromatiques comparables, même ceux séparés par un seul groupe méthylène. Elle permet également de séparer les amines simples, les lipides, les glucides et même les composés pharmaceutiquement actifs. Elle permet également de séparer les protéines, les peptides et les acides aminés. Enfin, elle permet de séparer les composés d'origine biologique. Dans les applications commerciales, la RPLC est fréquemment utilisée pour évaluer la concentration en caféine des produits à base de café afin de garantir la qualité et la pureté du café moulu. La HPLC est un instrument précieux pour l'analyste, notamment pour isoler une substance avant une analyse complémentaire. La séparation est dite en phase normale si la phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile. La séparation est dite en phase inverse si la phase stationnaire est moins polaire que la phase mobile. La période de rétention d'un composé en HPLC en phase inverse augmente à mesure que la polarité de l'espèce diminue. Trouver la bonne proportion de composés polaires et non polaires dans la phase mobile est essentiel pour une séparation réussie et efficace. L'objectif est que tous les produits chimiques soient élués le plus rapidement possible tout en préservant la capacité de résolution de pics spécifiques. Généralement, la silice ou l'alumine sont placées dans des colonnes pour la séparation de phase normale. Pour la séparation de phase inverse, des phases alkyle, aliphatique ou phényle sont généralement utilisées.