الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، والمعروفة أيضًا باسم الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط، هي تقنية كروماتوغرافية تُستخدم لفصل مزيج من المواد، وتُستخدم في الكيمياء الحيوية والكيمياء التحليلية لتحديد وقياس وتنقية مكونات هذا الخليط. تُحقن العينة السائلة في تيار من المذيب (الطور المتحرك) الذي يمر عبر عمود يحتوي على وسط للفصل (الطور الثابت). وأثناء انتقال العينات عبر العمود، تنفصل عن بعضها البعض من خلال عملية تُعرف باسم "الهجرة التفاضلية".
يتكون نظام HPLC بشكل أساسي من:
- مضخة ضخ (infusion pump)،
- جهاز أخذ عينات،
- عمود كروماتوغرافي،
- كاشف،
- وجهاز لتسجيل ومعالجة البيانات.
تشمل المكونات الأساسية: المضخة، العمود، والكاشف.
في عام 1941، وصف "مارتن" و"سينج" اكتشاف كروماتوغرافيا التقسيم السائل-السائل، مما وضع الأساس لتطوير كل من الكروماتوغرافيا الغازية السائلة (GLC) والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). كما اقترحا مفهوم "الارتفاع المكافئ للصفائح النظرية" (Height Equivalent to Theoretical Plates)، والذي أصبح لاحقًا مقياسًا معتمدًا لكفاءة الفصل الكروماتوغرافي.
أنواع تقنيات HPLC:
- كروماتوغرافيا الطور العادي
- كروماتوغرافيا الطور العكسي
- كروماتوغرافيا تبادل الأيونات
- كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي
- كروماتوغرافيا التآلف الحيوي
- كروماتوغرافيا التوزيع
أنواع تقنيات الإزاحة (Elution):
- الإزاحة المتساوية (Isocratic)
- الإزاحة المتدرجة (Gradient)
تُعتبر الإزاحة "متساوية" عندما لا تتغير تركيبة الطور المتحرك أثناء العملية. أما الإزاحة "المتدرجة" فتحدث عند تغيير نسبة المركبات القطبية إلى غير القطبية في الطور المتحرك خلال التحليل، وهي الطريقة المفضلة عندما تحتوي العينة على مكونات ذات نطاق واسع من القطبية.
في حالة تدرج الطور العكسي، يبدأ المذيب بقطبية نسبية ثم يصبح تدريجيًا أكثر لا قطبية. وتوفر هذه الطريقة فصلًا دقيقًا للقمم خلال وقت معقول.
رغم فعاليتها، تتطلب الإزاحة المتدرجة أجهزة أكثر تعقيدًا وتكلفة، كما أنها تزيد من صعوبة الحفاظ على معدل تدفق ثابت بسبب تغير تركيبة الطور المتحرك بشكل مستمر، مما يؤثر على قابلية تكرار النتائج، خصوصًا في الأجهزة ذات الجودة المنخفضة.
الكواشف في HPLC:
يوضع الكاشف في نهاية العمود ويجب أن يسجل وجود المكونات المختلفة في العينة مع استبعاد المذيب. ولهذا لا يوجد كاشف عالمي لجميع أنواع الفصل.
أكثر الكواشف استخدامًا هو كاشف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV)، نظرًا لقدرة معظم الجزيئات المتوسطة إلى الكبيرة على امتصاص هذه الأشعة. كما تُستخدم كواشف التألق ومؤشر الانكسار في تطبيقات خاصة. مؤخرًا، أصبح من الممكن دمج HPLC مع كاشف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لتحديد وتحليل المكونات النقية بعد فصلها في عملية واحدة متكاملة.
خصائص الفصل في HPLC:
- إذا كان الطور الثابت أكثر قطبية من الطور المتحرك، يُسمى الفصل "طورًا عاديًا".
- إذا كان الطور الثابت أقل قطبية، يُسمى "طورًا عكسيًا".
في الكروماتوغرافيا ذات الطور العكسي، تزداد فترة احتجاز المركب كلما انخفضت قطبيته. المفتاح لتحقيق فصل فعال هو إيجاد توازن مناسب بين المكونات القطبية وغير القطبية في الطور المتحرك، لتحقيق فصل دقيق وسريع.
عادةً ما تُملأ الأعمدة المستخدمة في الفصل العادي بالسيليكا أو الألومينا، بينما تُستخدم أطوار مرتبطة بألكيل أو فينيل في الطور العكسي.
استخدامات HPLC:
تُستخدم HPLC في التطبيقات الكمية (التحليل الكمي) والنوعية (التحليل النوعي) لتحديد وتركيز المركبات. وفي الوقت الحالي، تُستخدم تقنية الطور العكسي في معظم عمليات الفصل بالـ HPLC، بينما يُستخدم الطور العادي نادرًا.
كروماتوغرافيا تبادل الأيونات أكثر فعالية لفصل الأيونات غير العضوية مقارنة بالطور العكسي، والذي يُعد غير مناسب لفصل أنواع معينة مثل:
- عديد النيوكليوتيدات (التي تلتصق بشكل دائم بالطور العكسي)،
- أو السكريات المتعددة (التي لا تلتصق بالطور الصلب بسبب ارتفاع قطبيتها).
رغم هذه الاستثناءات، يمكن استخدام HPLC في الطور العكسي لفصل معظم أنواع المركبات، مثل:
- الهيدروكربونات البسيطة والعطرية،
- الأمينات، الدهون، السكريات، المركبات الدوائية،
- البروتينات، الببتيدات، والأحماض الأمينية،
- المركبات الحيوية المشتقة.
وفي التطبيقات الصناعية، تُستخدم HPLC في تحليل محتوى الكافيين في منتجات القهوة لضمان الجودة.