La chromatographie en phase inverse (RPC) est une technologie de chromatographie liquide qui sépare les molécules grâce aux interactions hydrophobes entre les molécules de soluté en phase mobile et les ligands liés à la phase stationnaire.
Avec la chromatographie liquide haute performance en phase inverse, la RP-HPLC a été reconnue comme la technique la plus performante pour les séparations physiques basées sur la HPLC. La RP-HPLC est essentielle aux applications quantitatives et spécifiques de séparation de molécules biologiques, notamment l'isolement de protéines, de peptides et de nucléotides à partir d'un large éventail de composants chimiques et biologiques.
Plus flexibles que les adsorbants en phase normale, les composés en phase inverse sont utilisés dans plus de 80 % des procédures actuelles de séparation chromatographique analytique. Les substances en phase inverse sont déjà utilisées efficacement dans de nombreuses applications, telles que la séparation quantitative de médicaments, de produits métaboliques et de composés biochimiques énergétiques, ainsi que pour l'extraction de contaminants à partir d'échantillons prélevés. L'efficacité de la chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour l'évaluation et la purification des peptides, des polypeptides courts et des médicaments n'a pas été reproduite pour l'observation et la purification des polypeptides plus volumineux et des protéines globulaires. Cela est dû à une diminution de la synthèse enzymatique et à de faibles rendements causés par la libération de protéines dénaturées lors de l'extraction par solvant. La procédure de chromatographie en phase inverse peut être résumée comme suit :
1. Améliore la solubilité des analyses polaires.
2. Utilise des solvants non toxiques.
3. Permet d'éliminer les sous-produits dangereux.
4. Substances actives mélangées à un solvant.
5. Garantit une restauration rapide des échantillons et une faible évaporation du solvant.
Dans de nombreuses procédures RPC, la phase mobile est un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible (tel que le méthanol ou l'acétonitrile). L'objectif du solvant organique est de maintenir une polarité suffisamment basse pour permettre la dissolution du soluté dans la phase mobile tout en la maintenant suffisamment élevée pour faciliter l'interaction de la molécule choisie avec la matrice stationnaire. L'acide trifluoroacétique et d'autres agents d'appariement d'ions peuvent également être utilisés dans certaines situations. En augmentant la concentration du solvant organique dans la phase mobile, la polarité est encore diminuée après la fixation de la molécule cible à la matrice de la colonne. L'élution par gradient consiste à modifier la quantité de solvant organique dans la phase mobile afin de séparer la molécule souhaitée. Dans les séparations préparatives, la chromatographie en phase inverse offre plusieurs avantages par rapport aux techniques en phase normale. En voici quelques-uns :
Cette technique résout les problèmes de solubilité typiques des liquides apolaires en phase normale.
• Utilise moins de solvants toxiques.
• Permet une récupération rapide des échantillons.
• Élimine les contaminants et les additifs de la phase mobile.
Facteurs affectant la séparation en chromatographie en phase inverse :
En chromatographie en phase inverse, la vitesse du processus de séparation est influencée par différents paramètres. Parmi ceux-ci :
Colonne :
En séparation en phase inverse, la résolution des grandes biomolécules est moins affectée par la longueur de la colonne que celle des petites molécules organiques. Les protéines, les gros peptides et les acides nucléiques peuvent tous être purifiés correctement à l'aide de colonnes courtes, et l'augmentation de la longueur de la colonne n'a aucun effet perceptible sur la résolution. Une augmentation de la longueur de la colonne peut parfois améliorer la résolution des petits peptides (y compris certains).
Phase mobile :
Dans de nombreux cas, les phases mobiles en chromatographie en phase inverse sont communément appelées « tampons ». Bien que les conditions de la phase mobile contiennent souvent des acides forts à faible pH et des concentrations importantes de solvants organiques, leur pouvoir tampon est limité. En conditions de fonctionnement proches des conditions physiologiques, il est important de maintenir un pouvoir tampon suffisant. Les grosses molécules se désorbent dans une plage très étroite de concentrations de modificateurs organiques, car les coefficients de partage des solutés de haut poids moléculaire sont extrêmement sensibles à de légères variations de la composition de la phase mobile.
Solvants organiques :
L’ajout d’un solvant organique (modificateur) diminue la polarité de la phase mobile aqueuse. En chromatographie en phase inverse, la force d’élution de la phase mobile augmente à mesure que sa polarité diminue. Les modificateurs organiques les plus fréquemment utilisés sont l’acétonitrile, l’isopropanol et le méthanol. Ces trois solvants sont essentiellement transparents aux UV. L’élution sur colonne étant généralement détectée par des détecteurs UV, cette propriété est essentielle pour la chromatographie en phase inverse. Suppression d'ions :
La rétention des protéines et des peptides en chromatographie en phase inverse peut être affectée par le pH de la phase mobile, car ces solutés contiennent des groupes ionisables. Le pH de la phase mobile détermine le niveau d'ionisation. L'acide trifluoroacétique et l'acide orthophosphorique sont deux acides forts couramment utilisés pour créer la phase mobile en chromatographie en phase inverse. Ces acides maintiennent un pH bas et empêchent l'ionisation des groupes acides des molécules de soluté. La quantité d'acides forts dans la phase mobile peut influencer l'ionisation des solutés.