الكروماتوغرافيا المعكوسة الطور هي تقنية من تقنيات الكروماتوغرافيا السائلة تعتمد على فصل الجزيئات من خلال التفاعلات الكارهة للماء (الهيدروفوبية) بين الجزيئات المذابة في الطور المتحرك (Mobile Phase) والروابط المرتبطة بالطور الثابت (Stationary Phase).
تم إثبات أن الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء باستخدام الطور المعكوس (RP-HPLC) هي أفضل تقنية للفصل الفيزيائي باستخدام HPLC، وقد أصبحت ضرورية في التطبيقات الكمية والنوعية لفصل الجزيئات البيولوجية، مثل عزل البروتينات والببتيدات والنيوكليوتيدات من مكونات كيميائية وبيولوجية متنوعة.
نظرًا لأن المركبات المعكوسة الطور أكثر مرونة من الممتزات ذات الطور العادي، فإنها تُستخدم في أكثر من 80% من إجراءات الفصل الكروماتوغرافي التحليلي الحديثة. وقد تم استخدام هذه المواد بنجاح في العديد من التطبيقات، مثل الفصل الكمي للأدوية، والمنتجات الأيضية، والجزيئات البيوكيميائية النشطة، وكذلك في استخلاص الملوثات من العينات المجمعة.
لكن فعالية RP-HPLC في تحليل وتنقية الببتيدات القصيرة والأدوية لم تُكرر بنفس الكفاءة مع الببتيدات الكبيرة والبروتينات الكروية. ويرجع ذلك إلى انخفاض إنتاج الإنزيمات وضعف المردود نتيجة لتحلل البروتينات بسبب المذيبات المستخدمة أثناء الاستخلاص.
يمكن تلخيص خطوات كروماتوغرافيا الطور المعكوس كالتالي:
- تعزيز ذوبانية المركبات القطبية.
- استخدام مذيبات غير سامة.
- التخلص من المنتجات الجانبية الضارة.
- خلط المواد الفعالة في مذيب.
- سرعة استعادة العينة وتقليل تبخر المذيب.
في العديد من طرق RPC، يكون الطور المتحرك عبارة عن خليط من الماء ومذيب عضوي متوافق (مثل الميثانول أو الأسيتونتريل). الهدف من المذيب العضوي هو الحفاظ على قطبية كافية تسمح بذوبان المادة المنحلة في الطور المتحرك، وفي نفس الوقت تمكين تفاعلها مع الطور الثابت.
قد تُستخدم أيضًا عوامل ازدواج الأيونات مثل حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك (TFA) في بعض الحالات. بعد ارتباط الجزيء الهدف بمصفوفة العمود، يتم تقليل القطبية تدريجيًا عن طريق زيادة تركيز المذيب العضوي، مما يؤدي إلى انفصال الجزيئات. تُعرف هذه العملية باسم الإزالة التدريجية (Gradient Eluمميزات الكروماتوغرافيا المعكوسة الطور مقارنة بالكروماتوغرافيا ذات الطور العادي: تحل مشكلات الذوبانية في السوائل غير القطبية - تزيل الملوثات والمواد المضافة للطور المتحرك - تستخدم مذيبات أقل سمّية - تتيح استرجاع العينة بسرعة.
العمود (Column):
في فصل الجزيئات الحيوية الكبيرة، لا تؤثر طول العمود بشكل كبير على الدقة كما هو الحال مع الجزيئات العضوية الصغيرة. يمكن تنقية البروتينات والببتيدات الكبيرة والأحماض النووية باستخدام أعمدة قصيرة. ولكن قد يُحسن العمود الأطول أحيانًا فصل بعض الببتيدات الصغيرة.
الطور المتحرك (Mobile Phase):
غالبًا ما يُشار إلى الطور المتحرك في كروماتوغرافيا الطور المعكوس على أنه "محلول منظم (Buffer)"، رغم أنه يحتوي عادةً على أحماض قوية وتركيزات عالية من المذيبات العضوية ولا يملك دائمًا قدرة تنظيمية حقيقية. عند العمل بالقرب من الظروف الفسيولوجية، يجب الحفاظ على قدرة تنظيمية كافية.
الجزيئات الكبيرة تتحرر من العمود ضمن نطاق ضيق جدًا من تركيز المذيب العضوي، نظرًا لحساسية معاملات التقسيم الخاصة بها للتغيرات الطفيفة في تكوين الطور المتحرك.
المذيبات العضوية:
يؤدي إضافة مذيب عضوي إلى تقليل قطبية الطور المتحرك. وتزداد قوة الإزاحة (eluting strength) كلما انخفضت القطبية. المذيبات الأكثر استخدامًا: الأسيتونتريل (Acetonitrile) - الميثانول (Methanol) -الأيزوبروبانول (Isopropanol) تتميز هذه المذيبات بأنها شفافة للأشعة فوق البنفسجية، وهي خاصية مهمة لأن الكشف في الكروماتوغرافيا غالبًا ما يتم باستخدام كواشف UV.
تثبيط التأين:
يؤثر الـ pH في الطور المتحرك على احتباس البروتينات والببتيدات نظرًا لاحتوائها على مجموعات قابلة للتأين. التحكم في pH يمنع تأين المجموعات الحمضية في الجزيئات. يُستخدم عادةً حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك (TFA) وحمض الفوسفوريك لهذا الغرض، لأنهما يحافظان على وسط حمضي.