La chromatographie préparative est le procédé d'isolement de la substance d'un échantillon par HPLC, généralement en grandes quantités, en collectant les fractions de pics séparées dès leur sortie du détecteur. L'objectif principal d'une séparation à l'échelle analytique est d'obtenir un chromatogramme présentant des pics nets, bien résolus et symétriques, fournissant les informations analytiques nécessaires. La chromatographie liquide haute performance (HPLC) à l'échelle préparative vise à créer une quantité de substance pure aussi facilement et économiquement que possible, en déposant l'échantillon dans un récipient collecteur avant sa récupération de l'éluant. La HPLC préparative est plus coûteuse que les procédés de purification classiques tels que la distillation, la cristallisation ou l'extraction, ce qui la rend réservée aux produits rares ou coûteux. La HPLC préparative évolue pour répondre à la demande croissante de produits chimiques de haute pureté pour le criblage d'activité, de toxicité et pharmaceutique.
Dans les industries chimiques et pharmaceutiques, ainsi qu'en biotechnologie et en biochimie, la chromatographie liquide haute performance (CLHP) préparative est utilisée pour l'isolement et la purification de produits importants. La quantité de substance à isoler ou à purifier varie considérablement selon la zone de travail. En biotechnologie, l'isolement d'enzymes commence à l'échelle du µg. C'est à cette échelle que l'on parle de micropurification. Pour identifier et clarifier la structure de substances chimiques inconnues en synthèse ou en chimie des produits naturels, il est nécessaire d'obtenir des molécules pures à des concentrations de l'ordre du milligramme. Les étalons, les composés de référence et les produits chimiques destinés aux tests toxicologiques et pharmacologiques nécessitent des quantités plus importantes, mesurées en grammes. L'objectif principal de la CLHP préparative est d'évaluer les cycles préparatifs selon trois paramètres clés : la pureté du produit, le rendement et le débit. Les méthodes CLHP préparatives ne peuvent pas être optimisées pour ces trois paramètres en raison de leur interdépendance. La colonne est essentielle à la mise en place d'une technique CLHP préparative fiable et reproductible. Dans les séparations analytiques, les isothermes de type Langmuir et le respect rigoureux de l'équation de résolution sont des hypothèses courantes. En HPLC préparative, où les colonnes sont régulièrement et substantiellement chargées, les isothermes et les relations communément admises ne sont plus applicables quantitativement.
En HPLC analytique, la capacité de la colonne est généralement définie comme une diminution de 10 % de l'efficacité due à la masse d'échantillon injectée. En chromatographie préparative, la quantité d'échantillon injectée peut dépasser la capacité de la colonne d'un ordre de grandeur ; c'est pourquoi une valeur absolue lui est rarement attribuée. En HPLC préparative, une surcharge se produit lorsque le produit ne peut être isolé avec la pureté ou les niveaux de récupération requis en raison d'une charge excessive. La capacité de la colonne doit tenir compte des autres molécules présentes dans l'échantillon, y compris la matrice. Lorsqu'on parle de capacité, on parle de capacité de l'échantillon plutôt que de facteur de capacité, qui mesure la rétention de l'analyte. La purification préparative vise à produire autant de produit purifié que possible par injection.
Pour développer une méthode, optimisez la séparation initiale sur une colonne analytique, surchargez-la tout en maintenant une séparation adéquate des composants d'intérêt, puis effectuez une mise à l'échelle vers une colonne préparative de dimensions adaptées à la quantité de composé à purifier, en suivant les directives décrites précédemment. Le choix des colonnes analytiques dépend généralement de la disponibilité de colonnes préparatives avec le même matériau de remplissage, préemballées ou en vrac pour un remplissage automatique. Avant de développer et d'optimiser une méthode préparative, il est important de disposer de colonnes analytiques et préparatives avec le même matériau de remplissage.
Les collecteurs de fractions sont disponibles dans le commerce en différentes tailles et types. Agilent Technologies propose des collecteurs de fractions spécifiques pour trois plages de débit, tandis que d'autres peuvent être utilisés à des débits faibles à élevés. Le collecteur de fractions micro convient aux débits inférieurs à 100 µL/min, le collecteur de fractions analytique aux débits inférieurs à 10 mL/min et le collecteur de fractions préparatif aux débits allant jusqu'à 100 mL/min. Certains instruments combinent l'échantillonneur automatique et le collecteur de fractions sur une même plateforme, utilisant une seule aiguille et une seule valve pour l'injection et le prélèvement de fractions. D'autres utilisent deux dispositifs, l'un pour l'injection et l'autre pour le prélèvement de fractions.